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17302193538l 該試劑盒用于體外定量檢測(cè)人 血清、血漿或其他相關(guān)生物液體中MT的濃度。
實(shí)驗(yàn)原理：
本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被有人褪黑素(MT)抗體的微孔中，依次加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的抗原，中間經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人褪黑素(MT)呈負(fù)相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。
試劑盒組成：
名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
預(yù)包被96孔酶標(biāo)板 Pre-coated Assay Plate | 8孔×12條 | 8孔×6條 | 無(wú) |
標(biāo)準(zhǔn)品 Standard | 2支 | 1支 | 按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋 |
通用稀釋液 Universal Diluent | 2x20mL | 1x20mL | 無(wú) |
濃縮HRP-抗原 HRP-antigen(100×) | 60μL | 30μL | 按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋 |
20×洗滌液 Wash Buffer (20×) | 2x10mL | 1x10mL | 按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋 |
底物（TMB） TMB Substrate | 10mL | 5mL | 無(wú) |
終止液 Stop Solution | 6mL | 3mL | 無(wú) |
封板膜 Plate Sealer | 4張 | 4張 | 無(wú) |
說(shuō)明書 Instruction Manual | 1份 | 1份 | 無(wú) |
預(yù)包被96孔酶標(biāo)板 Pre-coated Assay Plate | 8孔×12條 | 8孔×6條 | 無(wú) |
試劑盒參數(shù)：
性能 | |
靈敏度 | 3.4pg/mL |
檢測(cè)范圍 | 7.8-500pg/mL |
重復(fù)性 | 板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%. |
特異性 | 可檢測(cè)樣本中人的MT，且與其類似物無(wú)明顯交叉反應(yīng). |
需自備的設(shè)備及試劑：
1. 450±10nm 濾光片酶標(biāo)儀
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.
3. Eppendorf 移液器.
4. 蒸餾水或去離子水.
5. 脫脂棉吸水紙.
6. 37℃恒溫箱.
8. 準(zhǔn)備若干個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋管.
樣本處理及要求：
1. 試劑盒檢測(cè)范圍不等同于樣本中待測(cè)物的濃度范圍，建議實(shí)驗(yàn)前通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)預(yù)估樣本中待測(cè)物的濃度并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定樣本的實(shí)際濃度情況。如果樣品中待測(cè)物濃度過(guò)高或過(guò)低，請(qǐng)對(duì)樣本做適當(dāng)?shù)南♂尰驖饪s。
2. 若所檢樣本不在說(shuō)明書所列樣本之中，建議做預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其檢測(cè)有效性。
3. 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
4. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
5. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè)。
6. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
7. 其它生物標(biāo)本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)。
8. 樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。
9. 樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
檢測(cè)前準(zhǔn)備工作：
1. 請(qǐng)提10分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度工作液配制：加入1mL通用稀釋液至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為500pg/mL)，然后按照以下濃度：500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.2pg/mL、 15.6pg/mL、7.8pg/mL、0pg/mL進(jìn)行稀釋。
倍比稀釋方法：取7支 EP管，每管中加入500μL通用稀釋液,500pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混勻配成250pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔，不需要再?gòu)牡箶?shù)第二管中吸取液體，具體如下圖。
3. HRP-抗原工作液配制：使用前15分鐘將濃縮HRP-抗原于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮HRP-抗原稀釋成1×工作濃度(例：10μL濃縮液+990μL通用稀釋液)，當(dāng)日使用。
4. 1×洗滌液配制：取10ml 20×洗滌液到190ml蒸餾水中（從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正常現(xiàn)象，可放置室溫，輕搖均勻，待結(jié)
5. 晶溶解后再配置)。
操作步驟：
1. 從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 加樣：分別將樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照50μl每孔加入相應(yīng)孔中，空白孔加入50μL通用稀釋液，緊接著每孔加入50μL HRP-抗原工作液。蓋上封板膜后37℃溫育1小時(shí)。（建議：將待測(cè)樣本用通用稀釋液稀釋1倍后再加入酶標(biāo)板內(nèi)測(cè)試，從而減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)試結(jié)果的誤差影響，最后計(jì)算樣本濃度時(shí)需乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)。所有的待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)中建議設(shè)立復(fù)孔）。
3. 洗板：棄去液體，每孔加入300μL 1x洗滌液，靜置1分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板3次（也可用洗板機(jī)洗板）。
4. 加底物：每孔加入底物(TMB)90μL，蓋上封板膜，37℃避光溫育15分鐘。
5. 加終止液：每孔加入終止液50μL，立即在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
結(jié)果判斷：
1. 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時(shí)去掉空白組的值)。
2. 若樣品OD值低于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
典型數(shù)據(jù)和參考曲線：
以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
濃度（pg/mL) | 500 | 250 | 125 | 62.5 | 31.2 | 15.6 | 7.8 | 0 |
| 0.188 | 0.27 | 0.389 | 0.642 | 0.929 | 1.38 | 1.766 | 1.842 |
注意：本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本含量。
試劑盒性能：
1. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。
2. 回收率：在選取的健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入3個(gè)不同濃度水平的人MT，計(jì)算回收率
樣本類型 | 范圍 | 平均回收率 |
血清（n=8) | 81-101 | 96 |
血漿(n=8) | 92-105 | 101 |
樣本類型 | 范圍 | 平均回收率 |
3. 線性稀釋：分別在選取的4份健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人MT，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評(píng)估線性。
稀釋比例 | 回收率（%） | 血清 | 血漿 |
1：2 | 范圍（%） | 83-95 | 88-96 |
平均回收率（%） | 91 | 93 | |
1：4 | 范圍（%） | 89-104 | 87-108 |
平均回收率（%） | 93 | 98 |
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